Kryobiologie

Jiří Filip filipj@cs.felk.cvut.cz

FEL ČVUT

Semestrální práce do předmětu

FYZIKÁLNÍ METODY V MEDICÍNĚ

28.4.2000

TÉMA:

Kryogenní konzervace krve, tkání a kryochirurgie

TEORETICKÝ POPIS METODY:

Kryobiologie

Kryobiologie se zabývá studiem účinků nízkých teplot na biologické systemy. Dvěma základními směry tohoto oboru jsou :

Dlouhodobé konzervování bilogického materiálu (krev, kůže, kosti …)

Kryochirurgická destrukce nakažené tkáně

V kryobiologii pracujeme při teplotách blízkých -80o,-160 oC,použitím zkapalněného dusíku.

Základní problémy při kryokonzervaci biologických materiálů

Na první pohled by se nám mohlo zdát, že zmrazení tkání či celých orgánů, je jednoduché. Opak je však pravdou. V následujících řádcích nastíníme základní problémy, se kterými se v kryobiologii setkáme.

Pro příklad si vezmeme krvinky ve fyziologickém roztoku (9g soli na 1litr vody). Pokud jsou buňky, jako např. V našem případě krvinky jsou v takovém roztoku přímo zmraženy dojde k tzv. Dendritické krystalové deformaci (viz. Obr.1). Přední část zmrzlého roztoku není rovinná, ale vytvoří se v ní podlouhlé dendritické kanály resp. prohlubně ve směru ochlazování a některé buňky budou uvězněny mezi těmito prohlubněmi. Skutečný tvar vzniklý tímto způsobem můžeme pozorovat na obr.2 .

obr.1 obr.2

Dojde k vylučování solí především v okolí těchto kanálů. Jelikož, je buněčná membrána propustnější pro vodu než pro soli, dochází v důsledku zvýšené koncentrace soli v okolí buňky k osmotickému výtoku a buňka se smrští. Rozsah smrštění buňky zavisí předevsím na vodopropustnosti buněčné stěny a až dosáhne určité úrovně, buňky jsou nevratně zničeny. Poškození buněk osmotickým smrštěním zle omezit zvýšením rychlosti ochlazování. Toto je umožněno tím, že buňky nemají čas k dosažení rovnovážného stavu a tedy k osmotickému výtoku. Zdálo by se tedy, že rychlým ochlazením, které v současnosti není problém, bychom mohli biologický materiál s úspěchem zakonzervovat. Bohužel při rychlém ochlazování dojde u buněk, které obsahují velký podíl vody, k její krystalizaci. Tato vnitřní krystalizace je pro buňku smrtelná.

Vliv rychlosti ochlazování na počet přeživších buněk obr.3 .

Je třeba si uvědomit, že nikdy nejsme schopni zachovat všechny konzervované buňky. Jak je patrné z obr.3 maximální počet přeživších buněk je 85%. V našem případě jsme tedy zjistili, že optimální rychlost ochlazování, při které se alespoň s části vyhnem oběma výše zmiňovaným nežádoucím jevům je 80K/s. Této rychlosti jsme však schopni dosáhnout jen ve vzorku velmi malé velikosti. Za těchto tepelných podmínek tedy není možné konzervovat např. celou krevní konzervu, či kus tkáně. Z těchto důvodů se ukázalo jako nevyhnutelné použití zvláštních látek tzv. kryoprotektivních látek v mrazeném roztoku. Tyto látky byly objeveny uz v roce 1949. Jako ochrana spermatu před jeho poškozením mrazem byl poprvé použit glycerol. V současnosti se kromě něj používá také dimethylsulfoxid (DMSO) a hydroethylový škrob (HES). Kryoprotektivní látky snížují bodu mrazu konzervované směsi a zárověň ji zeskelnaťují. Tímto se zabrání krystalizaci buněk i osmotickému výtoku skrz buněčnou membránu. Bohužel nejvhodnější kryoprotektivum ještě nebylo objeveno. Hlavní nevýhodou většiny dnes používaných kryoprotektiv je jejich jedovatost, která způsobuje poškození buněk už při přidání kryoprotektiva do směsi ještě před jejím zmražením. Navíc po rozmražení před tramsplantací je nutno tyto látky z biologického materiálu odstranit, což je časově i cenově velmi nákladné.

Lyofilizace

Obr 1. Obr 2.

Další možností používanou při konzervaci buněk je lyofilizace (freezing-drying).Skládá se ze tří kroků. Prvním krokem je mrazení (obr.1.). Většina vody přítomné ve vzorku je přeměněna v kryslaly ledu. Tyto krystalky ledu společně s ještě nezmrzlou vodou vytvoří plynnou fázi. V druhém kroku (obr.2.)je vakuovým podtlakem odstraněna voda a)sublimací ledových krystalů zmizí plynná fáze b)poté je difunduje nezmrzlá voda ven z vzniklé skelné mřížky a je vyloučena na povrchu. Když už je vzorek úspěšně vysušen, může být skladován při pokojové teplotě bez ztráty kvality. Třetí fází je „zavodnění“ (rehydration) – obnovení původního stavu přidáním vody a vodního roztoku. Lyofilizace se používává ve zdravotnictví ke konzervaci vzorků infekčních nemocí atd. a masově v potravinářském průmyslu např. pro výrobu sušeního mléka a konzervaci potravin.

Klinické aplikace

Kryokonzervace izolovaných buněk

V současnosti můžeme tímto způsobem konzervovat různé druhy buněk (krvinky, hepatocyty, keratinocyty, sperma, embrya, …).

Konzervace krve – při 4oC bylo možno krev skladovat po dobu 49 dní. Často se stávalo,

že se prošlá krev musela vyhodit. Při kryokonzervaci je možno krev zachovávat téměř neomezeně dlouho. Toto je výhodné především pro autotransfůzi. Pro konzervaci krve bylo vyvinuto kryoprotektivum na bázi hydroxyethylového škrobu, které není ve srovnání s ostaními jedovaté a může pacientovi být zavedeno při transfůzi zárověň s krví. Pokud není překročena určitá koncentrace tohoto škrobu, dojde k jeho vstřebání v organismu.Odpadá tedy nákladné odstranění kryoprotektiva z konzervovaného biologického materiálu (v našem případě z krve).

Krevní vaky se zmrazují v šokových zmrazovačích, které dokážou např. 24 krevních vaků po 300ml zmrazit za 60minut na teplotu -30oC.

Kryochirurgie

Je zavedená metoda pro odstranění škodlivých tkání (nádory…), avšak ve srovnání s klasickou chirurgií má jednu nevýhodu. Metoda spočívá v podchlazení postižených míst na

velmi nízkou teplotu a tím k odumření odtraňované tkáně. Problém při aplikaci způsobuje nárust ledu v okolí kryochrurgického „skalpelu“, který znemožní monitorovat rozsah oblasti, kde již byla škodlivá tkáň odstraněna. V tomto směru pomohl až vývoj monitorovacích přístrojů na principu nukleární magnetické rezonance (viz. Obr.1). Tato slibná metoda umožňuje monitorovat průběh operace po několikasekundových intervalech. Možnost použití na léčení křečových žil dolních končetin, v hrudní chirurgii jako pooperační kryoanalgésie-mrazením mezižeberních nervů, při průduškovém zúžení, v gynekologii, k léčbě hemeroidů 1. A 2. stupně a análního štěpení, v dermatologii na odstranění bradavic a obecně k nekrvavému odtranění nežádoucích tkání.

Obr.1

Kryokonzervace tkání a orgánů

Jak je jistě známo je náhrada nefunkčních částí těla přirozenými tkáněmi, kostmi a orgány vždy výhodnější než jejich náhrada umělými prvky. Z tohoto důvodu je dlouhodobá kryokonzervace těchto prvků vždy žádoucí a umožňuje nám odtranit časovou tíseň vznikající při hledání vhodného příjemce daného orgánu a jeho dopravu k příjemci. Ve skutečnosti jsme však schopni konzervovat pouze jednoduché tkáně obsahující jediný typ buněčného základu(kůže, šlachy, chrupavky, srdeční chlopně, kosti). Celé orgány nebo dokonce části těla nejsme prozatím schopni konzervovat vůbec, především z důvodů jejich velikosti jak bylo nastíněno výše a také z důvodu, že různé typy buněk vyžadují odlišné konzervační postupy, které nejsme schopni současně dodržet. Rozsáhlé orgány jako jsou játra, srdce a ledvina mohou být tedy skladovány pouze po několik hodin při teplotách okolo nuly.

Výzvy do budoucna

Z množství isolovaných buněk existuje ještě mnoho, které nelze úspěšně kryokonzervovat. Například u buněk srdačního svalu, které jsou větší než 100mm, jejich celková vnitřní struktura způsobuje velmi dlouhé trvání než dojde k osmotickému vyrovnání s kryoprotektivem.

Mnoho geneticky upravených buněk je třeba z nejrůznějších důvodů konzervovat do budoucna. V buněčné kultuře totiž muže za čas dojít ke genetické změně a možnost porovnání s původním vzorkem je velmi užitečná.

Je třeba zcela porozumět interakci buněk a kryoprotektiv a vyvinout vhodné kryoprotektivní látky, které nebudou jedovaté.

Velké technologické zlepšení může přinést metoda lyofilizace (freeze-drying) konzervovaných buněk. Pokud se nám podaří pomocí vakuového podtlaku z techto buněk jemně odstranit v nich obsaženou vodu, můžou buňky tento proces přežít a být znovuoživeny opětovným přidáním vody.

Možností do budoucna je také skelnatěni (vitrification) – konzervace biologických systému za nízkých teplot bez vytváření ledu. Tím bychom se zbavili všech výše popsaných nevýhod způsobených tímto problémem. Problém je v tom, že orgán musí být proplachován velkou koncentrací velmi viskózního skelného roztoku dlouhou dobu před samotným snížením teploty. Nicméně v kombinaci s jinými technikami (rychlé chlazení, rychlé ohřívání, vysokotlaké nádoby, nejedovaté vitrifikační roztoky ) je zde otevřena možnost k úspěšnému vývoji této metody.

INDIKACE:

Potřeba dlouhodobé (resp. Časově neomezené) konzervace tkání a krve před transplantací (krev, kostní dřeň, srdeční pumpy, rohovky, … ).

Konzervace krve pro autotransfůzi

Dlouhodobé uchovávání vzorků tkání, virů pro následný výzkum s možnost vysledování případných genetických změn v současnosti.

V krychirurgii pro na léčení křečových žil dolních končetin, v hrudní chirurgii jako pooperační kryoanalgésie-mrazením mezižeberních nervů, při průduškovém zúžení, v gynekologii, k léčbě hemeroidů 1. A 2. stupně a análního štěpení, v dermatologii na odstranění bradavic a obecně k nekrvavému odtranění nežádoucích tkání. .

KONTRAINDIKACE:

Všechny buňky konzervované tkáně konzervaci nepřežijou (max. 85%). Možnosti zlepšení této nevýhody jsou v použití lyofilizační metody.

Při dodržení správných postupů nejsou jiné kontraindikace známy.

EKONOMIKA, VÝROBCI:

Programovatelné mrazící boxy – použitelné pro zmrazení embryí, spermatu, kostní dřeně,

srdečních pump a jiných tkání.

PLANER Kryo 10/1.7 programovatelné zařízení, kde je možno řídit programově celý průběh mrazícího procesu. Rychlost mrazeni až -50 oC/min. Rychlost rozmrazování až 10 oC/min Kapacita 30 2ml ampulí. Teplotní rozsah od 30oC do -180oC. Médium tekutý dusík. cena cca 400 000,-

V jiném provedení pro zmrazování krevních vaků.

PLANER Kryo 10/16 - důležité pro rychlé a správné zmrazení dosažení laminárního proudění v celém objemu chladící skříně (viz. Obr.). Pojme 11 krevních vaků

po 0,5 l. Ostatní parametry stejné jako předchozí typy.

cena cca 400 000,-

Zařízení pro kryochirurgii –

Erbe ERBOKRYO CA - univerzální zařízení na základě tekutého dusíku, pracující na

principu Joule-Thompsonova efektu. Za 5s po stisku nožního spínače je spínače sonda roztaje bez použití elektrického ohřevu. Možnost použítí sond různých tvarů pro různé účely.

cena cca 240 000,-